Show simple item record

dc.creatorMarić, Slađana
dc.creatorBošković, Radovan
dc.date.accessioned2023-12-04T13:51:45Z
dc.date.available2023-12-04T13:51:45Z
dc.date.issued2018-04-26
dc.identifier.urihttps://refri.institut-cacak.org/handle/123456789/817
dc.description.abstractNovo tehničko rešenje (nije komercijalizovano), odnosno nova genska proba Alel d ACO1 gena jabuke [Malus floribunda 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO1) gene, ACO1-d allele, partial cds], predstavlja inovativno rešenje koje poseduje stručnu komponentu celokupnog i samostalnog rezultata. Rezultati istraživanja se ogledaju u potvrđenom identitetu sekvence novootkrivenog alela d ACO1 gena, prethodno identifikovanog na bazi restrikcione analize ACO1 PCR proizvoda kod vrste Malus floribunda 821. U dostupnoj literaturi, diskriminacija identifikovanih alela ACO1 gena je bazirana na PCR amplifikaciji fragmenata dužine 525 bp (ACO1-1 alel koji odgovara alelu B) i/ili 587 bp (ACO1-2 alel koji odgovara alelu A), dok je u okviru ovog tehničkog rešenja identifikovan alel na osnovu amplifikacije kompletnog gena (fragment dužine 1.532 bp) i digestije PCR proizvoda sa šest restrikcionih enzima (EcoRI, EcoRV, HindIII, BamH1, PstI i RsaI). Daljom analizom je utvrđeno da restrikcioni enzimi EcoRI, EcoRV, HindIII, BamH1 i PstI dovode do istog modela polimorfizma, stoga je za diskriminaciju alela d ACO1 gena neophodna digestija sa jednim od pet navedenih enzima u kombinaciji sa RsaI enzimom. Posebno treba naglasiti da su proučavanja alelnog polimorfizma ACO1 gena u okviru ovih istraživanja sprovedena na velikom broju genotipova jabuke različitog porekla, uključujući i vrste roda Malus Miller. Ključni elementi koji su doveli do realizacije ove genske probe odnose se na: umnožavanje fragmenta ACO1 gena sa genomske DNK uzorka vrste jabuke Malus floribunda 821 (dd), primenom PCR metode; restrikcionu analizu PCR proizvoda ACO1 gena sa BamH1 и RsaI enzimima; prečišćavanje proizvoda PCR reakcije; pripremu inserta i ligaciju u vektor (pCR®2.1); transformaciju kompetentnih ćelija (One Shot™ TOP10F' kompetentne Escherichia coli); plazmid pre-test; ekstrakciju plazmida; digestiju plazmida (sa EcoRI, uz dodatnu restrikciju sa RsaI enzimom za potvrđivanje alela); analizu sekvenci (DNAStar Lasergene Software). Sekvenca alela d je prvi put u okviru ovih istraživanja deponovana u NCBI GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem КЈ206336 (verzija: КЈ206336.1). Alel d ACO1 gena poseduje četiri egzona i tri introna, ukupne dužine 1.532 bp (dužina egzona - 900 bp; dužina introna - 632 bp). Identičnost na nukleotidnom nivou između alela d i alela identifikovanih i prikazanih u okviru drugih tehničkih rešenja (JQ675679, JQ675680 i JQ675681 - sekvence alela a, b i c, po redosledu), kreće se od 98,4% (aleli d i a; aleli d i c) do 98,7% (aleli d i b). Najmanja divergentnost uočena je kod sekvenci prvog introna, a najveća kod sekvenci trećeg introna, u okviru kojih je pored razlika u pojedinačnim nukleotidima konstatovana delecija dužine 62 nukleotida kod alela b i d. Ova strukturna promena može uticati na nivo ekspresije, odnosno ukazuje na potencijalni značaj alela d za oplemenjivački rad na jabuci. Poređenjem dedukovanih aminokiselinskih sekvenci alela d ACO1 gena (300 aminokiselina) i sekvenci prethodno navedenih alela (a, b i c), utvrđen je nivo identičnosti od 97,3% (aleli d i a) do 98,7% (aleli d i b), što ukazuje da je proteinska sekvenca visoko konzervirana. ACC oksidaza pripada familiji Fe(II) – zavisnih oksigenaza za čiju aktivnost su neophodni ACC, kiseonik i askorbat kao supstrati, dok su Fe2+ i ugljendioksid neophodni kao kofaktori. Aminokiselinska sekvenca alela d ACO1 gena, identifikovanog u okviru ovog tehničkog rešenja, potvrdila je da su očuvani motivi za vezivanje Fe2+ [His-177-X-Asp-179-X(54)-His-234] i kosupstrata (Arg-244-X-Ser-246), kao i aminokiseline Lys-296 i Arg-299 u C-terminalnom heliksu, koje su esencijalne za aktivnost enzima. Direktna aplikativnost dobijenih rezultata se ogleda u razvijenoj metodi za preciznu, relativno jednostavnu i brzu detekciju alela d kod genotipova/vrsta jabuke, a koja podrazumeva amplifikaciju ACO1 genomskog fragmenta primenom PCR metode i digestiju sa dva restrikciona enzima - BamH1 и RsaI, pri čemu ovom alelu odgovaraju polimorfni fragmenti DNK sledećih dužina: 700 bp i 760 bp (fragmenti f1 i f2; digestija sa BamH1), kao i 530 bp i 680 bp (označeni kao fragment f1; digestija sa RsaI). Detektovani polimorfizam ACO1 gena i razvijene metode identifikacije alela se koriste za genotipizaciju vrsta, sorti, selekcija i potomstava jabuke.sr
dc.language.isosrsr
dc.relationinfo:eu-repo/grantAgreement/MESTD/Technological Development (TD or TR)/31064/RS//sr
dc.rightsclosedAccesssr
dc.sourceTehničko rešenje prihvaćeno od strane Matičnog naučnog odbora za biotehnologiju i poljoprivredu na 15. redovnoj sednici od 26. aprila 2018. godinesr
dc.subjectjabukasr
dc.subjectetilensr
dc.subjectACC oksidazasr
dc.subjectACO1 gensr
dc.subjectalelsr
dc.titleAlel d ACO1 gena jabuke [Malus floribunda 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO1) gene, ACO1-d allele, partial cds]sr
dc.typetechnicalReportsr
dc.rights.licenseARRsr
dc.rights.holderInstitut za voćarstvo, Čačaksr
dc.description.otherNovo tehničko rešenje (nije komercijalizovano) - nova genska proba (M85)sr
dc.type.versionpublishedVersionsr


Files in this item

Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record