Alel e ETR1 gena jabuke [Malus × domestica ethylene receptor 1 (ETR1) gene, ETR1-e allele, partial cds]

Abstract

Novo tehničko rešenje (nije komercijalizovano), odnosno nova genska proba Alel e ETR1 gena jabuke [Malus × domestica ethylene receptor 1 (ETR1) gene, ETR1-e allele, partial cds], predstavlja inovativno rešenje koje omogućava preciznu detekciju novoidentifikovanog alela e ETR1 gena kod sorti, selekcija i hibridnih potomstava jabuke. Ova genska proba je rezultat istraživanja usmerenih ka proučavanju alelnog polimorfizma gena uključenog u percepciju etilena - ETR1 gena, koji inicirajući kaskadu reakcija dovodi do fiziološkog odgovora. Treba istaći da do sada nema objavljenih podataka o ispitivanju alelnog polimorfizma gena koji kodiraju receptore za etilen kod jabuke, niti kod drugih vrsta biljaka. Takođe, posebno treba naglasiti i da su proučavanja alelnog polimorfizma ETR1 gena u okviru ovih istraživanja sprovedena na velikom broju genotipova jabuke različitog porekla, kao i da je alel e do sada identifikovan isključivo kod sorte ʻMcIntoshʼ (e,a/b/c/e). Ključni elementi koji su doveli do realizacije ove genske probe odnose se na: umnožavanje fragmenta ETR1 gena sa genomske DNK uzorka introdukovane sorte ʻMcIntoshʼ (e,a/b/c/e), primenom PCR metode sa dizajniranim prajmerima (ETR1–F i ETR1–R) i optimiziranim PCR uslovima u okviru ovih istraživanja; restrikcionu analizu PCR proizvoda ETR1 gena sa RsaI, AluI i HinfI enzimima; umnožavanje prvog i drugog dela genomskog fragmenta ETR1 gena sa novodizajniranim internim prajmerima (ETRint–F i ETRint–R1) kombinovanim sa ETR1–F i ETR1–R, za potrebe sprovođenja procedure kloniranja; prečišćavanje PCR proizvoda prvog i drugog dela genomskog fragmenta; pripremu inserta i ligaciju u vektor (pCR®2.1); transformaciju kompetentnih ćelija (One Shot™ TOP10F kompetentne Escherichia coli); plazmid pre-test; ekstrakciju plazmida; digestiju plazmida (sa EcoRI, uz dodatnu restrikciju sa RsaI i HinfI enzimima za potvrđivanje alela); analizu sekvenci (DNAStar Lasergene Software). Sekvenca alela e je deponovana u NCBI GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem JQ867363 (верзија: JQ867363.1). Alel e poseduje šest egzona i šest introna (prvi intron je lociran u vodećoj sekvenci, dok se ostali introni nalaze u kodirajućem regionu), ukupne dužine 4.056 bp (dužina egzona - 2.223 bp; dužina introna - 1.833 bp). Identičnost na nukleotidnom nivou između alela e i alela identifikovanih i prikazanih u okviru drugih tehničkih rešenja (JQ867359, JQ867360, JQ867361 i JQ867362 - sekvence alela a, b, c i d, po redosledu), kreće se od 98,8% (aleli e i d) do 99,1% (aleli e i a; aleli e i b). Najmanja divergentnost uočena je poređenjem sekvenci četvrtog introna, a najveća poređenjem sekvenci drugog, petog, odnosno šestog introna. Pored razlika u pojedinačnim nukleotidima, kod alela e je utvrđena delecija dužine 14 nukleotida u drugom intronu (pozicija 283-296), kao i insercija od 18 nukleotida u petom intronu (pozicija 301-318), koje nisu identifikovane kod alela a, b, c i d ETR1 gena. Dužine introna alela e ETR1 gena jabuke približno su iste kao kod kruške, dok su značajne razlike utvrđene poređenjem drugog i šestog introna jabuke i breskve. Poređenjem dedukovanih aminokiselinskih sekvenci alela e (741 aminokiselina) i sekvenci prethodno navedenih alela (a, b, c i d), utvrđen je nivo identičnosti od 98,8% (aleli e i c; aleli e i d) do 99,5% (aleli e i a), što ukazuje da je proteinska sekvenca visoko konzervirana. Na osnovu aminokiselinske sekvence alela e, evidentno je da ETR1 receptor jabuke pripada potfamiliji I, a karakteristike na osnovu kojih se svrstava su: tri transmembranska subdomena na N-terminalnom kraju receptora; postojanje tzv. GAF domena, čija funkcija još nije razjašnjena ali se pretpostavlja da je odgovoran za vezivanje cGMP; očuvani histidin-kinazni domen (konzervirani His-353 i H, N, G1, F i G2 motivi); pozicija introna u kodirajućem regionu. Detaljnom analizom aminokiselinske sekvence alela e ETR1 gena utvrđeno je da su očuvani svi segmenti esencijalni za funkcionisanje receptora. Direktna aplikativnost dobijenih rezultata se ogleda u razvijenoj metodi za preciznu, relativno jednostavnu i brzu detekciju alela e kod genotipova jabuke, a koja podrazumeva amplifikaciju genomskog fragmenta ETR1 gena primenom lančane reakcije polimeraze (detaljno opisana procedura u okviru elaborata) i digestiju sa tri restrikciona enzima - RsaI, AluI i HinfI, pri čemu ovom alelu odgovaraju polimorfni fragmenti sledećih dužina: 800 bp i 890 bp (fragmenti f1 i f2, po redosledu; digestija sa RsaI), 850 bp (fragment f1; digestija sa AluI) i 800 bp (fragment f1; digestija sa HinfI).